利用MaxPeak™高性能表面(HPS)改善合成肽类药物恩夫韦肽和HAART药物的分析

HIV是一种每年影响数百万人的病毒。如果不及时治疗，可能会发展为AIDS，导致感染者的免疫力进一步受损，易受各种疾病和癌症侵害。AIDS每年夺去了数十万人的生命，而针对HIV的治疗选择已经取得了进展。这些治疗方法包括HAART联合合成肽类药物（如恩夫韦肽）。

为了满足人们对快速、现代化，且能够分离现行HIV治疗标准品的分析方法的需求，我们开发了一种线性、可重现的HPLC-UV/MS方法，可在6分钟内完成分离。此外，我们还展示了与传统不锈钢系统相比，使用MaxPeak HPS进行合成肽分析的优势。

优势

• 与传统的不锈钢系统相比，MaxPeak HPS显示出更高的重现性
• Max Peak HPS可增加恩夫韦肽的信号峰面积和峰高，从而降低了定量下限
• 我们开发出了一种方法，可同时定量HAART和恩夫韦肽，且运行时间比之前的方法快了近四倍

人类免疫缺陷病毒(HIV)影响着全球数千万年轻人和老年人¹。 如果不及时治疗，HIV可能会进展为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，这种疾病会破坏感染者的免疫系统，使他们容易受到各种其他疾病和癌症的侵害^2,3。 虽然HIV或AIDS目前无法治愈，但HIV的治疗已经取得了长足的进步。目前，HIV患者可以使用多种高效抗逆转录病毒治疗(HAART)药物，通常需要联合不同的抗逆转录病毒药物使用，以针对每个患者获得理想的治疗效果^4,5。 如果患者对HAART治疗无反应，医生有时会开具另一种药物来改善预后。恩夫韦肽就是可以与HAART药物联合使用的候选药物之一⁶。 与抗病毒药物不同，恩夫韦肽不是小分子物质，而是一种合成肽⁷。

由于恩夫韦肽总是与其他药物联合使用，因此在现行的标准治疗中，含有HAART药物的溶液中恩夫韦肽的定量和分离至关重要。本应用纪要介绍了一种利用HPLC-UV/MS实现的线性、可重现方法，其中涵盖了包括恩夫韦肽在内的现有HAART组。多药分析方法的理念并不新颖，但据我们所知，目前可用于分离和定量HAART的方法中，还没有一种方法已经更新到可以包括恩夫韦肽^8,9。 此外，其他方法需要花费近20分钟才能完全分离一组HAART，而在这里，我们在不到6分钟即可完成分离。此外，研究表明，Waters™ HPS可以减少一些金属与肽的不良相互作用，从而避免色谱响应降低¹⁰。

制备标准储备液

恩夫韦肽乙酸盐购自Sigma Aldrich（密苏里州圣路易斯）。多替拉韦和比克替拉韦购自Selleck Chem（德克萨斯州休斯顿）。替诺福韦、拉米夫定、恩曲他滨和硫酸阿巴卡韦购自Cayman Chemical（密歇根州安阿伯）。储备液浓度因溶解度和所购物质的数量而异（表1）。制备过程中考虑了任何盐因素。有时会通过超声处理来帮助溶液中标准品的溶解。

储备液储存于2~8 °C下。鉴于DMSO的物理特性，储备液在冷藏环境下为凝固状态。制备标样之前，将解冻的储备液平衡至环境室温。

制备系统适应性标样：

使用含5%乙腈(ACN)的DI水溶液稀释储备液。混合配制储备液，使所有分析物的浓度均为100 µg/mL（HIV药物混标）。

此外，我们还制备了一份仅含恩夫韦肽的标准品，来单独考察对合成肽的方法性能。该标准品的制备使用含5%乙腈的DI水溶液稀释恩夫韦肽标准品至浓度为100 µg/mL（恩夫韦肽适应性标准品）。

制备线性和限制标准品：

使用5%乙腈稀释剂制备浓度为250 µg/mL的HIV药物混标（不包括恩夫韦肽）。使用含5%乙腈的DI水溶液对标准品进行后续稀释，针对混合物中的每种HIV抗逆转录病毒药物制定多个校准点。

实验中为恩夫韦肽绘制了单独的标准曲线。首先使用含5%乙腈的DI水溶液制备浓度为1000 µg/mL的恩夫韦肽标准品，以建立恩夫韦肽标准曲线标准品。使用含5%乙腈的DI水溶液对该标准品进行后续稀释，建立恩夫韦肽的多个校准点。

该标准品也用于制备定量限(LOQ)标准品，用于比较MaxPeak HPS系统与传统不锈钢系统。

方法条件：

由于肽和抗逆转录病毒药物的UV吸光度不同，因此使用两种波长进行分析^6,11。 对于恩夫韦肽的所有定量分析，使用214 nm波长，而对于抗逆转录病毒药物的定量数据，则使用260 nm波长。

分离方法的结果：

该方法在6次进样中使HIV药物混标的保留和分离表现出良好的重现性。在260 nm波长下，HIV药物混标中抗逆转录病毒药物的峰面积和保留时间%RSD均<1%（表2和表3）。在214 nm波长下，HIV药物混标中恩夫韦肽的峰面积和保留时间%RSD均≤1%（表4和表5）。

比克替拉韦(BIC)与多替拉韦(DOL)之间的平均分离度为1.3，但由于BIC和DOL通常不在HIV治疗中联合使用，因此这不应影响联合治疗的准确分析^5,12。 图1a和1b展示了在260 nm和214 nm下，6次进样的叠加色谱图，清晰展示了该方法的性能。在214 nm下，恩夫韦肽峰的响应较大。基线漂移是由分级梯度和流动相相关背景噪音增加共同导致的，这种现象在较低波长时较为常见。此外，这些色谱图证明了使用正确波长进行分析的重要性。

恩夫韦肽的质谱分析：

虽然恩夫韦肽可以通过UV检测器检测到，但为了辅助鉴定恩夫韦肽，我们还进行了质谱分析。恩夫韦肽的分子量为4492 g/mol⁷。 虽然其名义质量数已高于ACQUITY QDa质谱检测器的检测限，但恩夫韦肽有一个主要离子在1124 m/z，这意味着，当合成肽相对于其质荷比(m/z)带有4个电荷时能够被检测到^13,14。 下面的叠加色谱图展示了HIV药物标准品的UV和总离子流色谱图(TIC)，以及恩夫韦肽的选择提取离子流色谱图(XIC)（图2a到2c）。

线性结果：

我们研究了HIV药物混标中每种分析物的线性。鉴于合成肽与小分子抗逆转录病毒药物的响应存在显著差异，因此单独考察了恩夫韦肽的线性。利用Empower 3中的校准功能进行线性拟合，计算每种分析物的线性结果。所有线性回归系数均≥0.999。该方法的定量能力显而易见，表明它可用于质量控制检测（图3a和3b）。

Premier与不锈钢系统的结果比较：

该方法分别应用于不锈钢系统和MaxPeak Premier系统，以彰显MaxPeak HPS技术在合成肽分析方面的改进。在每种类型的仪器中各进样10次恩夫韦肽适应性标准品。MaxPeak HPS提供了更具重现性的数据集，峰面积增加了23%，峰高增加了10%。下面比较了两种系统的结果（表6，图4a到4b）。

定量限结果：

随着峰高和峰面积的增加，MaxPeak HPS系统的灵敏度也有所提高。为了衡量这一点，我们查看了每个系统的LOQ。根据人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)的规定，LOQ可以通过信噪比来测量¹⁵。 Premier MaxPeak HPS系统的LOQ标准品为3.5 μg/mL。在每套系统上将该标准品进样分析10次。Premier MaxPeak HPS系统的平均信噪比为14.2，高于建议的LOQ信噪比10。传统不锈钢系统的平均信噪比为2.4，低于建议的检测限(LOD)信噪比。MaxPeak HPS提供的信号峰面积和峰高增加有助于降低LOQ。（图5a和5b）。

在本应用纪要中，我们介绍了一种线性、可重现的方法，用于分析HAART和恩夫韦肽。该方法使用ACQUITY QDa质谱检测器，通过UV和台式质谱仪检测，在6分钟内即可分离和检测分析物。与传统的不锈钢系统相比，MaxPeak HPS解决方案改善了恩夫韦肽的色谱峰面积、峰高和整体灵敏度。

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