中性丢失和母离子扫描-串联四极杆质谱法在监测体内和体外样品的药物代谢物中的应用
摘要
在早期发现的体内或体外研究以及临床试验中检测药物代谢物对于药物开发的成功至关重要，代谢物检测可在药物发现期间检出代谢“软点”，并找出可在临床阶段检测的新代谢物质或毒性代谢物质。恒定中性丢失扫描和母离子扫描是一种简单快速的方法，能够检测生物体液（例如，血液制品、CSF和尿液）中和体外培养过程中的药物代谢物。本文概述了恒定中性丢失实验和母离子扫描实验在药物代谢研究中的应用和优势。
优势
快速检测生物体液中的药物代谢物及相关代谢物。扩展串联四极杆质谱仪的通用性。
简介
体外和体内药物代谢物的检测、鉴定和监测在药物发现和开发中发挥着重要作用。在药物研发过程中，通过检测药物代谢物（体外或体内）可以识别代谢“软点”，确定消除途径，优化分子的药代动力学特征1,2。 在临床前开发中，了解物种和剂量水平对化合物代谢特征的影响并确保毒理学物种具有足够的代谢覆盖率以支持人体临床试验，这一点非常重要。临床试验研究将在真实患者群体中测试候选药物，以评估疗效以及对特殊患者群体和不同种族的影响。通过安全性评估研究检测和监测这些样品中的已知代谢物以及具有潜在毒性的未知代谢物非常重要3。
在这些研究中，质谱与液相色谱联用是确定候选药物暴露量以及筛查样品中已知和未知代谢物的首选技术。恒定中性丢失和母离子扫描是两种强大而灵活的数据采集模式，可用于根据是否存在特定基团（例如，谷胱甘肽）或诊断碎片离子来筛查药物代谢物4.5。 本应用纪要将介绍如何使用这两种采集模式筛查生物体液中的药物代谢物。
实验
样品描述
有关安全性评估研究和样品前处理的完整详细信息，请参阅沃特世公司应用纪要：DMPK研究中的串联四极杆采集模式6。
方法条件
将2 μL等分尿样进样到2.1 × 100 mm Cortecs™ C8 2.7 µm色谱柱中进行分析。柱温保持在40 °C，流动相溶剂A为0.1%甲酸，流动相B为含0.1%甲酸的95:5 (v/v)乙腈:水溶液，以600 μL/min的流速在10 min内以线性反相梯度进行洗脱。在i)恒定中性丢失或ii)母离子扫描模式下运行正离子ESi质谱，监测色谱柱洗脱液。
液相色谱条件
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液相色谱系统： |
ACQUITY™ I Class UPLC™ |
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检测器： |
Xevo™ TQ-XS |
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样品瓶： |
Waters™全回收样品瓶（P/N：186004631） |
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色谱柱： |
2.1 x 100 mm Cortecs C8 2.7 µm（P/N：186010473） |
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柱温： |
40 °C |
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样品温度： |
8 °C |
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进样体积： |
2 µL（尿液） |
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流速： |
600 µL/min |
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流动相A： |
0.1 %(v/v)甲酸水溶液 |
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流动相B： |
含0.1%甲酸(v/v)的95%乙腈:5%水溶液 |
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梯度： |
见下表 |
梯度表（尿液和血浆筛查分析）
质谱条件
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质谱系统： |
Xevo TQ-XS |
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电离模式： |
正离子 |
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采集范围： |
m/z 50-800 |
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毛细管电压： |
2.0 Kv |
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碰撞能量： |
30 eV |
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锥孔电压： |
30 V |
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中性丢失： |
80 Da和176 Da |
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母离子： |
m/z=97、119、121 |
数据管理
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色谱软件： |
MassLynx™ v4.2 |
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质谱软件： |
MassLynx v4.2 |
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信息学软件： |
MassLynx v4.2 |
结果与讨论
在体外和体内研究中快速检测和表征药物代谢物对于高效、安全的药物发现和开发至关重要。采用LC-MS/MS检测培养样品或生物体液中的药物代谢物通过使用各种MS采集模式筛查样品来实现，这些模式特定于母体化合物中的诊断碎片离子或一类代谢产物，例如硫酸化物或葡糖醛酸化物。恒定中性丢失扫描和母离子扫描是两种MS数据采集模式，可采集碎片或类别的特定数据，用于代谢物分析。恒定中性丢失和母离子扫描质谱数据采集技术提供了一种富信息式分析物检测方法（请参阅沃特世应用纪要：DMPK研究中的串联四极杆采集模式）6。 恒定中性丢失扫描MS基于特定基团的丢失，通过两个四极杆的同步扫描进行检测。这种分析模式可用于检测常见的偶联代谢物，例如硫酸盐、葡糖苷酸等，也可以检测有潜在毒性的代谢物，例如谷胱甘肽的代谢物4。 母离子扫描是一种采集模式，其中第一个四极杆将对预设质量数范围内的离子进行扫描，这些离子随后会在碰撞室中被碎裂。最后一个分离四极杆将设置为允许在检测器中记录一个或多个要传输的特定、诊断性碎片离子5。 在这种采集模式下，研究人员可以利用已知的给药化合物碎片离子谱图来筛查生物样品中的药物相关物质。
为了说明这两种MS采集过程的应用，在雄性Wistar大鼠口服150 mg/Kg剂量的美沙吡啉（图1，一种抗组胺剂和抗胆碱能药）后，于第6天（D6）收集尿液样品，并采用反相UPLC-MS-MS进行分析7。 在正离子ESi模式下，使用恒定中性丢失或母离子扫描技术监测色谱柱洗脱液。
图1.美沙吡啉。
恒定中性丢失
在恒定中性丢失采集模式下，质谱仪的两个分离四极杆被设置为以恒定质量偏移同步扫描，从而可以检测样品中引起相同丢失的所有组分，无论是什么样品类型。硫酸化物和葡糖醛酸化物是药物在哺乳动物系统中最常见的两种代谢偶联形式。这两种偶联物具有恒定的中性丢失，分别为80.06和176.12 Da，因此通常在药物代谢研究中进行筛查。这种恒定中性丢失模式的LC-MS筛查分析也被用于监测潜在的毒性代谢物，例如谷胱甘肽的代谢物。这些代谢物具有特征性恒定中性丢失：吡咯谷氨酸m/z=129、GSH m/z=307（脂肪族和苄基硫酯），以及谷氨酸m/z=147（硫酯）。
美沙吡啉样品中的恒定中性丢失
为了说明该采集模式的用途，我们在D6（对雄性Wistar大鼠经口给予美沙吡啉后24 h）通过正离子MS使用葡糖苷酸和硫酸盐偶联物的恒定中性丢失模式分析尿样。利用反相UPLC-MS/MS（见实验部分）分析尿样，并通过正离子ESi（恒定中性丢失80和176 Da）监测色谱柱洗脱液，如图2所示。
图2.恒定中性丢失采集模式。
下图3显示了对质量数176.12 Da进行恒定中性丢失分析所得到的LC/MS谱图示例。在此图中，可以看到有多个分析物峰，导致尿样中的恒定中性丢失176 Da。其中大多数与药物无关，而是内源性分子或食物代谢的结果。
图3.以150 mg/Kg的剂量经口给予美沙吡啉后，D6（给药后24 h）大鼠尿液的恒定中性丢失分析（Da=176）。
图4所示为1.88 min处洗脱峰的MS1谱图。数据清楚显示在m/z=454.2处存在峰，表明该峰由葡糖醛酸与美沙吡林的羟基或N-氧化物代谢物偶联形成。需要对此峰进行靶向MS/MS分析，以确认该峰是否与药物相关。图5为来自恒定中性丢失数据的提取离子流色谱图（m/z=454），其中表明存在其他几个可能与药物相关的峰。
图4.以150 mg/Kg的剂量对大鼠经口给予美沙吡林，于D6（给药后24 h）对大鼠尿样进行恒定中性丢失分析（176 Da）所得1.88 min处洗脱峰的MS1谱图。
图5.以150 mg/Kg的剂量经口给予美沙吡林，于D6（给药后24 h）通过LC-MS/MS分析大鼠尿液得到的提取离子流色谱图（m/z=454）。
母离子扫描
与恒定中性丢失分析不同，母离子扫描会记录产生特定碎片离子或诊断碎片离子的所有分析物。在母离子扫描中，第一分离四极杆设置为在特定质量范围内进行扫描，此扫描范围内的所有离子都将被转移到碰撞室，并经由固定能量或碰撞能量梯度进行碎裂。随后，碎片离子将被导入第二分离四极杆，该四极杆设置为仅传输特定m/z值的离子（注：一次实验可以执行多次母离子扫描）。这些特定离子通常称为诊断碎片离子，因为它们与目标化合物的特定碎片相关。这种采集模式通常用于筛查分析物，例如复杂混合物（例如制剂、原材料和生物体液）中的药物杂质或代谢物。
美沙吡林样品的母离子扫描
美沙吡林的完整扫描MS和MS/MS分析结果显示m/z=262.2处有一个基峰，以及四个碎片离子m/z=217.1、121.1、119.1和96.9。利用这些碎片离子进行母离子扫描，可以解析尿样中的药物相关代谢物。图6所示为子离子m/z=119.1的所得色谱图。使用该采集模式检测到多个特征，色谱图的积分结果提示存在几个药物相关峰。例如，保留时间tR=2.96和tR=1.69 min处两个洗脱峰的MS谱图分别见图7A和图7B。这些峰的MS谱图分析结果提示这两个峰为(A)羟基化代谢物（m/z=278.3）和(B)美沙吡林的去甲基代谢物（m/z=248.2）。
图6.以150 mg/Kg的剂量经口给予美沙吡林，于D6（给药后24 h）使用正离子模式通过母离子扫描获得的大鼠尿液LC-MS/MS谱图（m/z=119.1）。
图7.以150 mg/Kg的剂量经口给予美沙吡林，于D6（给药后24 h）对大鼠尿样进行LC-MS/MS分析，A) tR=2.96和B) tR=1.69 min处洗脱峰的提取离子质谱。
类似地，碎片离子m/z=96.9的母离子分析显示，在0.9~3.5 min之间洗脱了11个不同的峰，如图8A所示。提取离子流色谱图（m/z=278.2）显示有两个单独的峰分别在tR=2.75 min和tR=3.36 min处洗脱，如图8B所示。进一步分析这两个峰的MS谱图显示：tR=2.75 min处的峰在m/z 233.2处产生了源内碎片离子。这与母分子中已知噻吩-吡啶环区域碎片（m/z 217.2）的羟基化（+16 Da）一致，如图8C所示。后洗脱的峰（tR=3.36 min）中不存在m/z=217.2碎片离子，表明此代谢物的羟基化位点不在噻吩-吡啶环区域而在分子的叔胺区域中。由于该峰的保留时间晚于美沙吡林的保留时间（tR=3.23 min），因此该峰很可能为美沙吡林的N-氧化物代谢物，如图8D所示。
图8.经口给予雄性Wistar大鼠150 mg/Kg剂量的美沙吡林后D6大鼠尿液的LC-MS/MS分析结果。A) 母离子扫描的提取离子流色谱图（m/z=96.88）；B) 提取离子流色谱图（m/z=96.88）；C) tR=2.75 min处洗脱峰的MS谱图；D) tR=3.36 min处洗脱峰的MS谱图。
结论
快速检测并表征候选药物的代谢转归是药物发现和分析研究的重要组成部分，有助于确定代谢“软点”、物种间毒理学覆盖率并检测潜在的有毒代谢物。沃特世串联四极杆质谱仪采用恒定中性丢失扫描和母离子扫描模式进行数据采集，提供了一种快速简单的方法用于评估体外或体内样品中是否存在药物相关物质。以150 mg/Kg的剂量给予美沙吡林后，恒定中性丢失分析鉴定出了雄性大鼠尿样中美沙吡林的三种主要葡糖苷酸代谢物。使用m/z=119.2和96.9两个碎片离子进行母离子扫描，可以轻松检出多种药物相关代谢物。对数据进行简单研究后发现，分析物中存在多个药物相关峰，包括具有拟定推测结构的N-氧化物、去甲基化和羟基化代谢物。这些数据展示了使用沃特世串联四极杆质谱仪进行恒定中性丢失和母离子扫描实验进行药物代谢筛查的优势。
参考资料
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